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酶联免疫斑点试验在糖尿病并发肺结核诊断中的应用价值

时间:2016-07-07 17:57来源:未知 作者:2015xdyy 点击:
基金项目:广州市卫生局医药科技项目一般引导项目(编号:2013A011060009) 高鸣谭耀驹覃红娟傅红梅赖小敏周德旺梁启德陈俊宇姚银钗:广州市胸科医院广东广州510095 酶联免疫斑点试验在
基金项目:广州市卫生局医药科技项目一般引导项目(编号:2013A011060009)
高 鸣 谭耀驹 覃红娟 傅红梅 赖小敏 周德旺 梁启德 陈俊宇 姚银钗:广州市胸科医院 广东广州 510095

酶联免疫斑点试验在糖尿病并发肺结核诊断中的
应用价值

高 鸣 谭耀驹 覃红娟 傅红梅 赖小敏 周德旺 梁启德 陈俊宇 姚银钗
ELISPOT TEST APPLICATIONS IN THE DIAGNOSIS OF PULMONARY TUBERCULOSIS IN DIABETES
GAO Ming, TAN Yaoju, QING Hongjuan, et al


  【摘 要】 目的 评价酶联免疫斑点试验(ELISPOT)在糖尿病并发肺结核诊断中的应用价值。方法 选择广州市胸科医院糖尿病并发可疑肺结核病人共132例,对其进行PPD试验和ELISPOT试验。根据临床诊断分为糖尿病合并菌阳肺结核组、菌阴肺结核组、非结核、合并结核(菌阳组+菌阴组)四组,分别比较ELISPOT试验和PPD试验在这四组人群中的阳性率差异,并计算ELISPOT试验和PPD试验在糖尿病合并菌阳、菌阴、非肺结核、合并结核(菌阳+菌阴组)人群中的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值,并且分析血糖控制情况对实验结果的影响。结果 只有在糖尿病合并非结核人群中,ELISPOT试验和PPD试验的阳性率有显著性差异,PPD试验的假阳性率较高。在其它三组人群中,两个试验的阳性率无显著性差异。PPD试验在糖尿病合并菌阳、菌阴组中的特异性较低(<40%),而ELISPOT试验在每组人群中都保持了较高的敏感性和特异性(>80%)。ELISPOT试验对糖尿病合并结核(菌阳+菌阴)诊断的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为836%、980%、875%和424%。血糖控制较差的人和血糖控制较好的人群比较,ELISPOT试验和PPD试验诊断的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值并没有显著性差异。结论 ELISPOT试验是糖尿病并发肺结核早期诊断的快速有效的方法。
  【关键词】 糖尿病,结核,ELISPOT
  doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2015.12.032 

  糖尿病患者并发结核的发病率逐年升高,比普通人群中结核的发病率高4~8倍。数百万糖尿病患者正面临感染结核的风险,世界范围的七个结核高发国家同时也是糖尿病高发的国家。我国大约有193%~291%的糖尿病人并发结核。及时诊断和治疗糖尿病患者的结核病对全球结核控制非常重要,但是肺部不典型的影像学表现使糖尿病并发结核的早期诊断变得困难,使发病率和死亡率升高,因此迫切需要快速的辅助诊断工具对其进行早期诊断。
     近来,采用酶联免疫斑点实验(ELISPOT)定量检测受检者外周血单个核细胞(PBMC)对结核分枝杆菌特异抗原的IFN-γ释放反应,被应用于诊断结核感染。该方法的原理是T细胞与结核分枝杆菌特异性抗原孵育时产生IFN-γ,这类抗原包括了目前广泛使用的早期培养滤液蛋白10(CFP-10)和早期分泌蛋白(ESAT-6)。前期研究证实该方法在单纯性肺结核诊断方面有着很好的应用价值。本研究探讨该方法在糖尿病人合并肺结核方面的应用价值。
     1 研究对象
     收集2012年6月~2014年6月广州市胸科医院门诊病人132例,其中男100例,女32例。所有病人均有糖尿病史,在接受胰岛素治疗或口服降糖药治疗,或者已经确诊为糖尿病。所有病人都有两周以上的发热或者呼吸道症状,可疑肺结核。
     2 方法
     对入选患者做PPD皮肤试验,分离外周血做ELISPOT实验,痰涂片找抗酸杆菌根据痰涂片找抗酸杆菌、结核菌培养、胸部影像学等相关辅助检查,将这132例患者分为3组:①菌阳肺结核组:痰涂片或者培养阳性;②菌阴肺结核组:有活动性肺结核的症状和胸片表现并对抗结核治疗有效的病人;③非结核组:其它诊断可以解释症状发生的原因或者没有进行抗结核治疗病情就得到好转。分别比较PPD、ELISPOT两种试验在糖尿病并发肺结核(菌阳组+菌阴组)菌阳组、菌阴组、非结核组诊断中的阳性率的差异,并计算出敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值,判断各自在糖尿病并发肺结核诊断中的应用价值。
2.1 PPD试验
     对所有入选患者均皮内注射5 IU PPD试剂(1∶ 2 000),72 h后观察结果,有红肿硬结且直径≥5 mm者,或者有水疱或破溃者判为PPD试验阳性,否则判为阴性。
2.2 结核多肽特异性IFN-γELISPOT检测方法
     在前期的工作中,我们得到两个结核特异性的多肽,来源于MTB分泌性蛋白ESAT-6的E6(氨基酸18-32,中国授权发明专利号CN201111303648)和E7(氨基酸25-39,中国授权发明专利号2008102205231),还有一个来源于结核特异性的CFP-10多肽,C-14(氨基酸52-65)。E6,E7,C14和E6+E7,E6+E7+E14的混合物各10 μg/mL用来作为IFN-γ ELISPOT实验的刺激物。通过密度梯度离心(Ficoll-Paque Plus;Amersham Bioscience,Netherlands)从外周血淋巴细胞中分离出外周血单个核细胞,然后将细胞重悬在有10%胎牛血清的RPMI1640(含有100 u/mL的盘尼西林和链霉素,Sigma)的培养液中。调整细胞浓度,使加入已包被了鼠抗人IFN-γ抗体(5 ug/mL,eBioscience)的ELISPOT板(MultiScreen-IP;Millipore,MA)中的细胞为每孔25×105个。加入了不同抗原刺激物的细胞放在37℃,5%CO2的细胞培养箱中孵育18 h。阳性对照孔加入豆蔻酸-佛波酯-乙酸酯(PMA,25 ng/mL,Sigma)和离子霉素(Ionomycin,1 ug/mL;Sigma)的混合物作为阳性对照,不加刺激物的培养液作为阴性对照,不加细胞的培养液作为背景对照。 孵育时,对多肽产生应答的细胞在多肽刺激下会产生IFN-γ。用含有005%吐温20的磷酸盐缓冲液(PBST)洗板10次,加入生物素标记的鼠多克隆抗人IFN-γ抗体(05 μg/mL;eBioscience),室温孵育2 h。再用PBST洗板5次后,加入碱性磷酸酶标记的链霉素(2 μg/mL;Thermo)。最后,加入四唑硝基蓝(NBT/BCIP)底物缓冲液使斑点显色。最后,用蒸馏水清洗板终止反应。用ELISPOT 读板分析仪(Cellular Techonology Ltd)读取斑点数(Spot Forming Cells,SFP)。所得斑点数乘以系数4,即为每百万(106)所检测PBMC中斑点数(SFP/106 PBMC),实验组的每百万PBMC中斑点数减去阴性对照的SFP,为统计记录数据(即抗原多肽特异性IFN-γ应答水平)。SFP>=50认为是阳性。
2.3 统计学分析
     应用SPSS 130统计软件进行分析,以敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值来评价ELISPOT方法和PPD方法,计数资料以率表示,采用2检验。P<005时为差异有统计学意义。
     3 结果
3.1 表1为ELISPOT试验在糖尿病合并菌阳、菌阴、非结核、结核(菌阳+菌阴)患者中的阳性率比较和PPD试验在这四组人群的阳性率比较。132例患者做ELISPOT试验,其在糖尿病合并菌阳、菌阴、非结核、结核(菌阳+菌阴)患者中的阳性率比较,卡方检验得不同组的阳性率间差异有统计学意义(P<0001);进一步两两比较非结核组与菌阳组、菌阴组的阳性率比较有统计学意义(P<005),且非结核组均低于菌阳组、菌阴组的阳性率;结核(菌阳+菌阴)组与非结核组的阳性率比较有统计学意义(P<005),且非结核组低于结核(菌阳+菌阴)组的阳性率;菌阳组、菌阴组、结核(菌阳+菌阴)组间的阳性率比较差异无统计学意义(P>005);125例患者做PPD皮肤试验,取硬结直径≥5 mm为阳性标准。其在糖尿病合并菌阳、菌阴、非结核患者、结核(菌阳+菌阴)患者中PPD试验阳性率比较,近卡方检验得不同组的阳性率间差异无统计学意义(P=0517)。

表1 ELISPOT试验在四组人群的阳性率比较和PPD试验在四组人群的阳性率比较

(n)

分组
ELISPOT试验 PPD试验
+ - 2 P + - 2 P
菌阳组 54 10 45.736 <0.001 50 11 2.275 0.517
菌阴组 43 9     44 8  
非结核组1)2) 2 14     8 4  
结核组(菌阳+菌阴)3) 97 19     94 19
 注:与菌阳组比较,1)P<005;与菌阴组比较,2)P<005;与非结核组比较,3)P<005
3.2 根据表1,计算出在糖尿病合并结核(菌阳组+菌阴组)中,ELISPOT试验的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别是836%、980%、875%、424%,PPD试验的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别是831%、921%、333%、174%。对糖尿病合并菌阳结核组中,ELISPOT试验的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别是843%、875%、964 %、583%,PPD试验的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别是8197%、333%、862%、2667%。在糖尿病合并菌阴结核组中,ELISPOT试验的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别是827%、889%、955%、640%,PPD试验的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别是846%、3333%、846%、3333%。
3.3 表2为在糖尿病合并菌阳、菌阴、非结核、结核(菌阳+菌阴)四组人群中,ELISPOT试验在每组的阳性率与PPD试验阳性率比较,经卡方检验得,仅非结核组的阳性率比较有统计学差异,其余三组的阳性率比较均无统计学差异(P>005)。

表2 四组人群的ELISPOT试验阳性率与PPD试验
阳性率比较

n(%)

  ELISPOT
试验阳性率
PPD试验
阳性率
2 P
菌阳组 54(84.3) 50(83.0) 0.13 0.719
菌阴组 43(82.7) 44(85.0) 0.07 0.791
非结核组 2(12.5) 8(66.7 ) 8.763 0.003
结核组(菌阳+菌阴) 97(83.6) 94(83.2) 0.008 0.93

3.4 根据糖尿病人血糖控制水平把糖尿病人分成两组:a组,血糖控制较差,不能同时达到以下三个标准:2个月内测糖化血红蛋白<7%,空腹血糖<72 mmol/L,餐后血糖<10 mmol/L;b组,血糖控制好,同时达到以上三个标准者。表3为ELISPOT试验检测血糖控制较差的a组与控制较好的b组人群感染结核情况,经卡方检验比较敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值后结果差异均无统计学意义(P>005)。见表3。
     表4为PPD试验检测血糖控制较差的a组与控制较好的b组人群感染结核情况,经卡方检验比较敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值后结果差异均无统计学意义(P>005)。

表3 ELISPOT试验检测血糖控制较差的a组与
控制较好的b组人群感染结核情况

 

指标 血糖控制
较差人群
血糖控制
较好人群
2 P
结核的(菌阳和
 菌阴)敏感性
82.1(55/67) 85.7(42/49) 0.271 0.602
特异性 85.7(6/7) 88.9(8/9) 0.036 0.849
阳性预测值 98.2(55/56) 97.7(42/43) 0.036 0.850
阴性预测值 33.3(6/18) 53.3(8/15) 1.34 0.247

表4 PPD试验检测血糖控制较差的a组与
控制较好的b组人群感染结核情况

 

指标 血糖控制
较差人群
血糖控制
较好人群
2 P
结核(菌阳和菌
 阴)的敏感性
85.1(57/67) 87.0(40/46) 0.079 0.778
特异性 40.0(2/5) 28.6(2/7) 0.171 0.679
阳性预测值 95.0(57/60) 88.9(40/45) 1.364 0.243
阴性预测值 16.7(2/12) 25.0(2/8) 0.208 0.648

4 讨论
     全世界范围内的糖尿病的流行率在不断上升,据估计将从2000年的28%上升到2030年的44%,也就是说糖尿病患者将从2000年的171亿增加到2030年的366亿[1]。糖尿病人发展成活动性结核的风险比非糖尿病人高3倍[2]。在某些糖尿病高发区,因糖尿病而导致的结核病的风险甚至比HIV病人导致的结核病的风险还要高。糖尿病患者是感染肺结核的高危人群。据报道糖尿病患者的结核患病率相对危险度较单纯性肺结核患者增加3~4倍,分析原因可能与以下主要因素有关[3]:①糖代谢紊乱:糖尿病患者血液多处在高血糖状态,这种状态可提高血浆渗透压,限制白细胞吞噬能力,为结核菌大量繁殖提供条件;②脂肪代谢紊乱:糖尿病患者亦普遍存在脂肪代谢障碍,脂肪分解的甘油三酯为结核菌生长输送了丰富的营养;③免疫功能低下:糖尿病患者典型的表现是胰岛素分泌不足,使血清中因缺乏胰岛素受体,导致机体抵抗力下降,尤其是细胞免疫功能弱化,极易感染结核菌。长期高血糖状态会加重糖尿病合并肺结核患者细胞免疫功能紊乱[4]。因此临床上迫切需要快速有效的诊断方法。
     目前,结核的实验诊断包括了临床、影像学、微生物学、病理学及分子生物学等方法,但是其诊断仍然十分困难,存在诊断率低、误诊率高、耗时长等缺点。近年的研究发现[5],结核分枝杆菌RD1区编码一些结核分枝杆菌特异性复合抗原,如ESAT-6和CFP-10,它们是重要的T淋巴细胞抗原,为结核感染的免疫活性T淋巴细胞识别,并产生高水平的IFN-γ。Elispot技术以及近年发展起来的T-SPOT.TB试剂盒在结核病的诊断中不仅快捷、方便,而且其敏感性和特异性达到了83%~97%[6-7]。本课题组在前期的工作中,筛选出了E6、E7和C14三种MTB特异性多肽,并以此为基础建立的ELISPOT技术与T-SPOT.TB的敏感性和特异性相似[8]。
     本研究中,ELISPOT试验和PPD试验诊断糖尿病合并肺结核(菌阴组+菌阳组)、菌阳结核组、菌阴结核组的阳性率无显著性差异,但是在糖尿病合并非结核组人群中, PPD试验的阳性率要高于ELISPOT试验的阳性率,即在非结核人群中PPD试验的假阳性率较高。另外,PPD试验在糖尿病合并菌阳、菌阴组中的特异性较低(<40%),而ELISPOT试验在每组人群中都保持了较高的敏感性和特异性(>80%)。PPD皮肤试验作为结核感染的诊断标准的同时可以作为肺结核诊断的参考指标,其敏感性和特异性受卡介苗、患者年龄以及细胞免疫功能等影响。由于PPD包含了一系列抗原,包括了牛结核分枝杆菌和几种非结核分枝杆菌抗原,在广泛接种卡介苗的人群中,PPD试验的特异更低。而ELISPOT试验的ESAT-6和CFP-10抗原是由结核分枝杆菌基因组RD1区编码,其特异性比PPD更高[9]。ELISPOT试验在单纯性结核病诊断中的应用价值已被很多研究证实,本课题组的ELISPOT试剂对于单纯性肺结核的诊断的敏感性和特异性都高于传统的PPD试验[8]。糖尿病合并肺结核(菌阳结核+菌阴结核)人群中,ELISPOT诊断的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值都要高于PPD试验,尤其是在糖尿病合并菌阴结核组中。菌阴,尤其是胸片表现不典型肺结核的诊断日益成为临床医生的难题。由于缺乏最准确可靠的直接病原诊断“金指标”而用间接诊断依据包括询问病史、收集临床症状和体征、胸片、纤支镜检查等综合判断[10],在本研究中ELISPOT试验对糖尿病合并菌阴肺结核的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别是827%、889%、955%和640%,能够辅助临床诊断糖尿病合并菌阴肺结核。因此ELISPOT试验可以作为糖尿病合并肺结核的快速有效诊断方法,可以达到快速诊断,早期治疗的目的。
     ELISPOT方法是免疫学方法,结果的判断依赖细胞免疫过程中IFN-γ的产生。以前的研究认为由于糖尿病人细胞免疫功能低下,分泌IFN-γ的T细胞功能受到影响,IFN-γ的分泌量减少,理论上,敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值都应该受到影响。YAMASHIRO等[11]发现链霉素诱导的糖尿病小鼠感染了结核分枝杆菌后,产生低水平的IFN-γ。但是2011年,MARY C WALSH等[12]报道IFN-γ

(下转第97页)(上接第94页)
释放试验检测糖尿病合并结核的人群的敏感性并没有低于单纯性肺结核病人,可能的解释是糖尿病合并结核感染的机体处于更加严重的细菌负担,因此可以使体内的免疫刺激更强。在表3、表4中可以看出,ELISPOT或PPD试验检测a、b两组人群的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值都无显著性差异。可能的原因是一方面正如YAMASHIRO报道的,血糖控制得差的a组,体内的免疫刺激更强,所以产生的IFN-γ与b组人群比较并不一定减少;另一方面,本研究样本量少,限制了进一步的研究,需要我们增大样本量做下一步的研究。
     综上所述,ELISPOT试验检测糖尿病并发结核有良好的敏感性和特异性,可以作为早期诊断糖尿病并发结核的快速有效的方法。

参考文献
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[12] MARY C,WALSH. Sensitivity of Interferon-γ release assays is not compromised in tuberculosis patients with diabetes[J]. Int J Tuberc Lung Dis, 2011,15(2): 179-184.

(责任编辑:赵老师)
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